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分子實(shí)驗(yàn)介紹——熒光定量pcr檢測(cè)
熒光定量pcr是檢測(cè)生物樣品中rna含量的普遍的方法，通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，fish檢測(cè)，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。目前主要使用sybr green和taqman法對(duì)rna含量進(jìn)行檢測(cè)。sybr green在低樣本量時(shí)成本較低，目前選用的較多。
sybr green i是一種只與dna雙鏈結(jié)合的熒光染料。當(dāng)它與dna雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出熒光；從dna雙鏈上釋放出來時(shí)，熒光信號(hào)急劇減弱。因此，在一個(gè)體系內(nèi)，其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈dna分子的數(shù)量。sybr green熒光染料法定量pcr的基本過程是：1、開始反應(yīng)，當(dāng)sybr green染料與dna雙鏈結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光。2、dna變性時(shí)，sybr green染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成pcr產(chǎn)物。4、聚合完成后，sybr green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量pcr系統(tǒng)檢測(cè)到熒光的凈增量加大。
實(shí)驗(yàn)流程：細(xì)胞或組織rna提取-rna濃度檢測(cè)-rna逆轉(zhuǎn)錄-定量pcr檢測(cè)。
結(jié)果示例：
圖 a *擴(kuò)增曲線圖；b *擴(kuò)增溶解曲線圖；c mrna相對(duì)表達(dá)量變化
從圖中可以擴(kuò)增曲線可以看出目的rna擴(kuò)增效果，溶解曲線可以看出引物識(shí)別特異性情況，通過使用δδct方法計(jì)算可以得到每個(gè)組中目的mrna表達(dá)變化。
常規(guī)堿基分子量：
11.如何溶解引物？
答：干燥后的引物質(zhì)地非常疏松，開蓋前好離心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，將引物粉末收集到管底。根據(jù)計(jì)算出的體積加入去離子無菌水或10mm tris ph7.5緩沖液，室溫放置幾分鐘，振蕩助溶，離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水，因?yàn)橛行┱麴s水的ph值比較低（ph4-5），引物在這種條件下不穩(wěn)定。
12.如何保存引物？
答：引物合成后，經(jīng)過一系列處理和純化步驟，旋轉(zhuǎn)干燥而成片狀物質(zhì)。引物在溶解前，室溫狀態(tài)下可以長期保存。溶解后的引物-20度可以長期保存。如果對(duì)實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性要求較高，合成的od數(shù)較大，建議分裝，避免反復(fù)凍融。修飾熒光引物需要避光保存。
16.長鏈引物為什么出錯(cuò)的幾率非常高？
答：引物合成時(shí)，每一步反應(yīng)效率都不能達(dá)到100%，產(chǎn)生堿基插入、缺失、置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失，這種心情可以理解。但是猶如pcr擴(kuò)增，不可能保證擴(kuò)增產(chǎn)物中沒有突變，引物合成也不可能保證100%正確。要知道，引物合成中發(fā)生錯(cuò)誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶pcr擴(kuò)增過程所產(chǎn)生的頻率都要高。做引物合成，長鏈引物合成，pcr實(shí)驗(yàn)室，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準(zhǔn)備。
17.如果測(cè)序發(fā)現(xiàn)突變，該如何處理？
答：遇到這種情況，首先和核酸合成廠家取得聯(lián)系，生產(chǎn)人員會(huì)檢查生產(chǎn)的原始記錄，主要是核對(duì)合成序列是否和定單一致，他們?cè)陔娔X中一般會(huì)保留所有原始數(shù)據(jù)。在確認(rèn)引物合成序列沒有輸錯(cuò)的情況下，建議重新挑取測(cè)序，可能會(huì)找到正確的。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，40個(gè)堿基以下的引物，宿遷pcr，測(cè)1-2個(gè)就可以了；40個(gè)以上的特別是用于全片段拼接合成的，就需要多測(cè)一些了。一般情況下，每個(gè)突變的位點(diǎn)都不一樣，提示正確的總是有的，*檢測(cè)多少錢，就是如何找到它。也可以要求公司將引物*重合一次，不過重合的引物和次的引物一樣，都可能含突變，不會(huì)因?yàn)橹睾系囊锞蜏p少您的遇到問題的幾率。*拼接過程中，如果發(fā)現(xiàn)一段區(qū)域突變點(diǎn)不多，就多測(cè)幾個(gè)，否則就重合一下引物。
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